基因探針,即核酸探針,是一段帶有檢測標記,且順序已知的,與目的基因互補的核酸序列(DNA或RNA)。基因探針通過分子雜交與目的基因結合,產生雜交信號,能從浩瀚的基因組中把目的基因顯示出來。根據雜交原理,作為探針的核酸序列至少必須具備以下兩個條件:①應是單鏈,若為雙鏈,必須先行變性處理。②應帶有容易被檢測的標記。它可以包括整個基因,也可以僅僅是基因的一部分;可以是DNA本身,也可以是由之轉錄而來的RNA。
寡核苷酸探針的來源是什么?
DNA探針根據其來源有3種:一種來自基因組中有關的基因本身,稱為基因組探針;另一種是從相應的基因轉錄獲得了mRNA,再通過逆轉錄得到的探針,稱為cDNA探針。與基因組探針不同的是,cDNA探針不含有內含子序列。此外,還可在體外人工合成堿基數不多的與基因序列互補的DNA片段,稱為寡核苷酸探針。
寡核苷酸探針是怎么制備的?
進行分子突變需要大量的探針拷貝,后者一般是通過分子克隆獲得的。克隆是指用無性繁殖方法獲得同一個體、細胞或分子的大量復制品。當制備基因組DNA探針前,應先制備基因組文庫,即把基因組DNA打斷,或用限制性酶作不完全水解,得到許多大小不等的隨機片段,將這些片段體外重組到運載體(噬菌體、質粒等)中去,再將后者轉染適當的宿主細胞如大腸肝菌,這時在固體培養基上可以得到許多攜帶有不同DNA片段的克隆噬菌斑,通過原位雜交,從中可篩出含有目的基因片段的克隆,然后通過細胞擴增,制備出大量的探針。
為了制備cDNA探針,首先需分離純化相應mRNA,這從含有大量mRNA的組織、細胞中比較容易做到,如從造血細胞中制備α或β珠蛋白mRNA。有了mRNA作模板后,在逆轉錄酶的作用下,就可以合成與之互補的DNA(即cDNA),cDNA與待測基因的編碼區有完全相同的堿基順序,但內含子已在加工過程中切除。寡核苷酸探針是人工合成的,與已知基因DNA互補的,長度可從十幾到幾十個核苷酸的片段。如僅知蛋白質的氨基酸順序量,也可以按氨基酸的密碼推導出核苷酸序列,并用化學方法合成。
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